Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung eines endogenen 5-Lipoxygenase-Inhibitors aus Mono-Mac-6-Zellen

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• Dietlind Straif

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Dietlind Straif untersucht in dieser Arbeit die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung eines endogenen Inhibitors der 5-Lipoxygenase aus Mono-Mac-6-Zellen. Die Isolierung des Inhibitors aus dem 100.000g-Überstand undifferenzierter MM6-Zellen erfolgte in vier Schritten. Zunächst wurde eine Gelpermeationschromatographie an Sephacryl S-200 durchgeführt, gefolgt von einer Trennung der aktiven Fraktionen über einen schwachen Anionenaustauscher (Fractogel π EMD DEAE-650). Der effektivste Reinigungsschritt war die Isolation der hemmenden DEAE-Fraktionen über eine PhenylSuperose-FPLC-Säule (RESOURCE TM PHE). Eine weitere Aufreinigung erfolgte mittels einer zweiten HIC-chromatographischen Trennung mit einer IsopropylSuperose-FPLC-Säule (RESOURCE TM ISO). Die Reihenfolge der Säulen minimierte den Pufferaustausch und die Aufkonzentrierung großer Fraktionsvolumina. Die Identifizierung des Proteins geschah durch Western Blot, MALDI-TOF-Massenspektrometrie und die Bestimmung eines Teils der Aminosäuresequenz. Ein polyklonaler Antikörper gegen die humane Glutathion-Peroxidase (GPx1) und Katalase wurde im Western Blot verwendet. Das Protein zeigte in der SDS-PAGE eine Größe vergleichbar mit humaner GPx1. Die Masse des isolierten Enzyms stimmte mit den berechneten Molekulargewichten des Monomers und der prozessierten Form überein. Der N-terminale Bereich des Inhibitors war für den Edman-Abbau blockiert, jedoch konnten aus einem Frag

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• Année de publication: 1999